胶质母细胞瘤新疗法：线粒体抑制剂靶向药治疗GBM

　　多形性胶质母细胞瘤是什么？

　　多形性胶质母细胞瘤（GBM）是成人常见的原发性恶性脑肿瘤，预后差，中位生存期约15-18个月。GBM标准治疗（SoC）包括最大限度的手术切除肿瘤，辅以放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗。放化疗抵抗是造成GBM患者预后差的主要原因，根据目前的研究，放疗和化疗耐药源于GBM细胞的遗传和功能异质性，这种异质性是由一小部分胶质瘤干细胞（GSCs）驱动的。GSCs高表达ATP结合转运蛋白，首先分化成祖细胞样细胞，然后转化为各种分化的GBM细胞（d-GCs），逃避免疫攻击并浸润周围正常组织。

胶质母细胞瘤新疗法：线粒体抑制剂靶向药治疗GBM

　　体外研究还显示TMZ增加GSCs富集，可间接导致肿瘤复发。为开发选择性杀死GSCs或限制药物的不良反应，应致力于靶向GSCs特有的生化特性或代谢途径。其中，线粒体是维持GSCs生存和GSCs干性必不可少的结构。也有研究报道称，胶质瘤细胞间的线粒体异质性可通过线粒体DNA（mtDNA）拷贝数的丢失，产生对TMZ的抗性；敲除这种异质性，可恢复胶质瘤细胞对TMZ的敏感性。美国加利福尼亚大学兽医学院分子生物科学系的Sandipan Datta等通过体外体内实验表明，靶向线粒体的药物可诱导GSCs凋亡，抑制GSCs生长；结果发表于2021年1月的《Biomed Pharmacother》上。

　　研究者确认，GSCs是人源性原代胶质瘤干细胞（0827/0923），于是参照神经干细胞进行细胞培养。在Oxytherm Clark-type电极系统下，测定细胞氧耗实验；两种GSCs细胞（0827/0923）和d-GCs细胞的DNA和RNA，分别使用的是DNeasy blood & tissue kit和RNeasy plus mini kit试验盒提取，然后进行PCR相关基因表达和蛋白定量检测。细胞活力实验采用CellTiterGlo测定，细胞凋亡试验通过Muse-细胞分析仪完成。

胶质母细胞瘤新疗法：线粒体抑制剂靶向药治疗GBM

　　六大研究结果总括如下：

　　1. 与d-GCs相比，GSCs具有致瘤依赖的线粒体异质性和线粒体功能较弱。0827相比，0923细胞具有更强的致瘤性和侵袭性（致瘤性100%:60%），但线粒体功能较0827细胞弱，约相差2倍。与d-GCs相比，GSCs的线粒体氧耗更低。这从侧面验证 “Warburg效应”，即细胞致瘤性和侵袭性越强，线粒体依赖程度越差，无氧糖酵解能力越强。此外，还观察到，在侵袭性较低的细胞系中，线粒体拷贝数越多。

　　2. GSCs线粒体相关基因表达量降低。研究者利用PCR技术检测与线粒体编码相关基因ND2和CYB在d-GCs和GSCs的表达量。结果表明，ND2和CYB在d-GCs和GSCs两种细胞的表达量显著不同；d-GCs中，ND2升高趋势明显，CYB升高不明显，这一结果也被western蛋白定量结果证实。

　　3. 经典线粒体抑制剂抑制GSCs生长的作用比TMZ高100倍。研究者分别使用线粒体抑制剂寡霉素A（线粒体复合物V抑制剂）、抗霉素A（线粒体复合物III抑制剂）和鱼藤酮（线粒体复合物I抑制剂）检测其对GSCs和d-GCs的生长抑制作用。首先观察到的是GSCs比d-GCs更敏感，其次是这些线粒体剂抑制对GSCs生长的抑制作用比TMZ高100倍。目前GBM的化疗不能选择性抑制GSCs，是其长期化疗无效原因。

　　4. 在致瘤性较低的GSCs中，存在经典的线粒体抑制剂诱导的内在细胞凋亡途径，而致瘤性较高的GSC对凋亡诱导具有抗性。研究者用线粒体抑制剂孵育细胞48小时后进行凋亡检测，发现三种线粒体抑制剂剂量依赖性，增加致瘤性较低的（0827）细胞的膜联蛋白V阳性细胞的百分比，而致瘤性较强的细胞系对线粒体抑制剂的细胞凋亡诱导具有抗性。研究者利用免疫印迹分别在Caspase 9、Caspase 3及PARP1中给予证实。0923细胞对凋亡的抵抗伴随着LC3蛋白的上调，暗示自噬可能与线粒体抑制剂的GSCs特异性抗增殖作用有关。

　　5. 经典的线粒体抑制剂在体外GSCs抑制浓度下不影响原代星形胶质细胞；即使最高浓度的抑制剂，也只能致使15%的星形胶质细胞受其影响。

　　6. 在FDA批准的药物中，筛选出的较温的线粒体抑制剂，在体外实验中显示比TMZ有更好的GSCs选择性抗增殖活性。研究者通过筛选1600种临床试验和FDA批准的线粒体抑制剂，最终确定三种药物（pyrvinium pamoate、trifluoperazine和mitoxantrone）对GSCs的毒性是TMZ的50倍，其中选择性最好是pyrvinium pamoate。pyrvinium pamoate和mitoxantrone，在0827细胞中诱导Caspase 9/3的裂解，表明其诱导经典线粒体抑制剂介导的细胞凋亡途径。

　　通过实验证明FDA批准的线粒体抑制剂可选择性诱导GSCs细胞毒性，致其凋亡；靶向线粒体可以为GBM治疗提供潜在的选择。

　　参考资料：

1. 　　Datta S,et al. Biomed Pharmacother. 2021 Jan;133:111058. doi: 10.1016/j.biopha.2020.111058. Epub 2020 Dec 8.
2. 　　Repurposing FDA approved drugs inhibiting mitochondrial function for targeting glioma-stem like cells