脑恶性肿瘤的诊疗新发现

　　运用测序技术剖析恶性肿瘤遗传变异、非特异新陈代谢主题活动及演变全过程，对肿瘤发生及进度体制的科学研究有关键实际意义，且为恶性肿瘤临床医学治疗出示理论基础。相对性于总体转录组测序，单细胞测序技术性更有益于诠释肿瘤异质性，且能从比较有限的试品中得到 大量的信息内容。成年人最普遍的脑肿瘤是脑转移瘤，而原发性脑肿瘤以胶原纤维母细胞瘤（glioblastoma，GBM）更为普遍，存有极强的异方差性。

脑恶性肿瘤的诊疗新发现

　　在分子结构病理学具体指导精准医学的情况下，脑肿瘤病人或因没法接纳脑颅手术治疗而丧失分子结构病理学检验和更合理的靶向治疗治疗的机遇。另外，因为脑颅手术治疗外伤很大，大部分病人没法在病况进度时反复手术治疗治疗，运用血细胞、脑组织等微创手术穿刺活检的方法开展现病史检测并具体指导精准医疗治疗是脑部肿瘤治疗的方位。因而，由于单细胞测序技术性的优点，其在脑肿瘤临床医学诊治中的运用深受希望。文中将具体描述单细胞测序技术性步骤及运用该技术性开展恶性肿瘤科学研究的进度，并融合脑肿瘤的特点对单细胞测序技术性在其诊治中的运用开展未来展望。

　　1.单细胞测序技术性发展趋势简述

　　肿瘤细胞具备基因多变性，在恶性肿瘤起止和进度全过程中可累积很多基因遗传突然变化，如单多肽链突然变化、染色体异常等。运用测序技术测量肿瘤细胞突然变化种类、作用，有利于研究癌病产生发展趋势体制，并有目的性地研制开发治疗计划方案。根据DNA复制的生物学基本原理，Sanger等运用双脱氧核苷酸链终止法开展DNA片段转录组测序，打开了基因组测序的新时期。但Sanger转录组测序法实际操作繁杂、用时长、成本增加，规模性运用受到限制。

　　伴随着莹光上色和毛细血管微阵列电泳技术运用于基因组测序，第二代测序技术（next-generationsequencing，NGS）根据“边生成边转录组测序”的标准，完成规模性、转录组测序，明显减少了转录组测序成本费。NGS法也具备一定局限，包含转录组测序精彩片段较短，不可以体现基因长精彩片段的基因变异，如拷贝数变异（copynumberalteration，CNA）和染色体结构基因变异。第三代测序运用单分子结构即时转录组测序及根据二代测序的生成长读长测序技术，DNA片段读长能致数十Kb，另外可开展详细的mRNA转录组测序，有益于对独特遗传基因的外显子裁切开展精准剖析。

　　以往恶性肿瘤多个学科学研究一般选用NGS和/或Sanger测序技术开展恶性肿瘤机构总体转录组测序，得到 一块恶性肿瘤机构中不计其数个体细胞的整体特点，在辨别并挑选恶性肿瘤有关突然变化遗传基因、转录因子层面获得很多成效，推动了恶性肿瘤疾病诊断和治疗的发展趋势。但恶性肿瘤机构存有异方差性，且不一样亚型的肿瘤干细胞中间的相互影响可危害病症过程。与恶性肿瘤机构总体转录组测序对比，单细胞测序技术性在评定恶性肿瘤内异方差性及处理独特临床医学难题层面具备优点。

　　第一，单细胞测序技术性可用以剖析恶性肿瘤内异方差性。第二，针对一些侵润生长发育的恶性肿瘤，单细胞测序技术性的运用可更高效率地剖析恶性肿瘤信息内容。比如胰腺肿瘤穿刺活检机构中肿瘤干细胞仅占30%，其他为很多栽培基质体细胞。这时，肿瘤干细胞中基因基因变异可因頻率过低而不可以验出，尤其是CNA等基因变异可因测序深度不够而被忽视。第三，针对恶性肿瘤机构样版，临床医学常因抽样少等缘故样版受到限制，如细针穿刺活检样版、血细胞循环系统肿瘤干细胞（circulatingtumorcells，CTCs）等，不能搭建转录组测序百度文库，单细胞测序或能为临床医学管理决策出示有使用价值的信息内容。

　　2.恶性肿瘤单细胞测序技术性简述

　　相对性于总体转录组测序，单细胞测序数据信息的获得取决于一些技术性的发展趋势，包含单独体细胞的分离出来及筛分、单细胞全基因组测序和全外显子转录组测序、单细胞转录组增加及转录组测序、单细胞表观遗传转录组测序，以考虑转录组测序底物规定、转录组测序成本费减少和充足的转录组测序体细胞总数、操纵并评定转录组测序結果的偏倚及确定误差。

　　2.1恶性肿瘤单细胞分离出来及筛分

　　分离出来及筛分用以转录组测序的单独体细胞是恶性肿瘤单细胞测序技术性的关键流程，关键包含实体瘤体细胞、肿瘤干细胞（cancerstemcells，CSCs）、CTCs和脊髓播散肿瘤干细胞（disseminatedtumorcells，DTCs）。在其中，实体肿瘤可根据机械设备激光切割及胶原酶消化吸收分散化为单独体细胞，而DTCs来自骨髓穿刺。另外，该技术性还可运用于肿瘤微环境中其他类型体细胞的分离出来及筛分，如细胞免疫。CTCs是存有于病人循环中的肿瘤干细胞，在血夜中总数很少，1ml血夜仅有数十或数以百计CTCs，现阶段分离出来关键根据其物理学或生长习性。与循环中的红细胞对比，CTCs容积更高、相对密度小且所需正电荷与表层蛋白质有关，由此可运用梯度方向抽滤、微液体惯性力聚焦点（microfluidicinertialfocusing，MIF）、微滤过器（microfabricatedfilters，MF）法和双向电泳法等开展分离出来。

　　CTCs的分子生物学分离出来方式包含免疫系统磁珠分离出来（immunomagneticseparation，IS）、经微液体免疫系统分离出来（microfluidics-enabledimmunoseparation，MI）、固相酶联免疫黑斑技术性（epithelialimmunospot，EPISPOT）法和侵入试验（invasionassay，IA）等。在其中最普遍的是IS法，该技术性运用带上捕捉剂（一般为特异性抗体）的免疫系统磁珠聚集具备非特异膜蛋白的CTCs。根据该技术性创建的CellSearch监测系统已得到 美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）的准许。

　　充分考虑转录组测序成本费及肿瘤异质性，在将试品分散化成单独体细胞后，有时候需进一步筛分用以转录组测序的单细胞，尤其是以实体瘤中获得的样版。样版体细胞挑选一般依据CTCs的独特分子结构标示或体细胞燃气表开展，包含流式细胞术（flowcytometry，FACS）、微液体（microfluidics）系统软件、显微镜实际操作（micromanipulation）法和激光器捕捉显微镜激光切割（lasercapturemicrodissection，LCM）。

　　2.2单细胞全基因组测序和全外显子转录组测序

　　从单独体细胞中获取的遗传信息不能开展全基因组测序及剖析，因而，一般应用多种换置增加（multipledisplacementamplilication，MDA）、PCR或二者紧密结合的方式开展基因扩增，如多种淬火合成环循环系统增加（multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles，MALBAC）。PCR技术性最开始用以单细胞基因增加，包含挑选散播在基因中的保守序列或任意寡核苷酸编码序列做为扩增引物。因为基因中不一样结构域与引物设计融合工作能力不一样，在基因增加的全过程中，存有很多的编码序列信息内容遗失。

　　现阶段挑选处在细胞周期中的四倍体体细胞、简并寡核苷酸引物设计PCR（degenerateoligonucleotideprimed-PCR，DOP-PCR）开展增加，另外，挑选自身拷贝的体细胞开展转录组测序很有可能造成 結果存有偏倚。MDA技术性运用29DNA聚合酶和耐核酸外切酶的任意引物设计开展全基因增加，该全过程不用反复溫度循环系统，且失衡率小于基本PCR。

　　MALBAC技术性最先运用独特的任意引物设计（包含27个碳水化合物固定不动编码序列和八个碳水化合物的可变性编码序列）开展MDA，再对增加物质开展PCR扩增。有研究表明，MDA的基因普及率高过DOPPCR及MALBAC，运用该方式转录组测序对单多肽链结构域基因变异（singlenucleotidevariants，SNV）的诊断率高些；但D